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La inhibición de la citocromo P450 (CYP450) isoformas por isoniazida: Inhibición potente de CYP2C19 y CYP3A RESUMEN isoniazida (INH) sigue siendo el fármaco más seguro y rentable para el tratamiento y profilaxis de la tuberculosis. El uso de INH ha aumentado en los últimos años, en gran parte como resultado de la coepidemic de la infección por virus de la inmunodeficiencia humana. Con frecuencia se da de forma crónica a los pacientes críticamente enfermos que están coprescribed múltiples medicamentos. La capacidad de INH para elevar las concentraciones en plasma y / o toxicidad de los fármacos coadministrados, incluidos los de rango terapéutico estrecho (por ejemplo, fenitoína), se ha documentado en los seres humanos, pero los mecanismos implicados no se conocen bien. Utilizando microsomas de hígado humano (HLM), probamos el efecto inhibidor del INH en la actividad de las isoformas comunes metabolizadoras de fármacos del citocromo P450 humano (CYP450) usando reacciones sonda sustrato isoforma específica. experimentos de incubación se realizaron a una concentración única de cada sonda sustrato en su valor m K con un intervalo de concentraciones de INH. CYP2C19 y CYP3A se inhibieron potentemente por INH de una manera dependiente de la concentración. A los 50 M INH (6,86 g / ml), las actividades de estas isoformas se redujo en 40. INH no mostraron una inhibición significativa (10 a 50 M) de otras isoformas (CYP2C9, CYP1A2, CYP2D6 y). Para estimar con precisión las constantes de inhibición (valores de Ki) de cada isoforma, cuatro concentraciones de INH se incubaron en una serie de cinco concentraciones de sustrato sondas específicas. El K media i valores (desviación estándar) para la inhibición de la CYP2C19 por INH en VAM y CYP2C19 humana recombinante eran 25,4 6,2 y 13 2,4 M, respectivamente. INH mostró inhibición no competitiva potente de CYP3A (K i 51,8 2,5-75,9 7,8 M, dependiendo del sustrato usado). INH fue un inhibidor débil no competitivo de CYP2E1 (K i 110 33 M) y un inhibidor competitivo de CYP2D6 (K i 126 23 M), pero la media valores de Ki para la inhibición de CYP2C9 y CYP1A2 estaban por encima de 500 M. La inhibición de uno o ambos CYP2C19 y isoformas CYP3A es el mecanismo probable por el cual INH retarda la eliminación de los fármacos coadministrados, incluyendo la fenitoína, carbamazepina, diazepam, triazolam, y primidona. acetiladores lentos de INH pueden tener un mayor riesgo de interacciones farmacológicas adversas, como el grado de inhibición fue dependiente de la concentración. Estos datos proporcionan una base racional para la comprensión de la interacción fármaco con INH y predicen que otros fármacos metabolizados por estas dos enzimas también pueden interactuar. Isoniazida (INH), introducido en la década de 1950, sigue siendo uno de los agentes más seguros y rentables para tratar la tuberculosis (9). Debido a la creciente incidencia de la tuberculosis que ha resultado de la coepidemic de la infección por virus de la inmunodeficiencia humana (32), el uso de INH en la prevención (9. 17) y de tratamiento (9) de la tuberculosis está en aumento. INH a menudo se administra de forma crónica a pacientes críticamente enfermos que están en varios medicamentos para tratar la tuberculosis y las enfermedades relacionadas con el SIDA por micobacterias (18, 45), aumentando el potencial de interacciones adversas con otros medicamentos. En los seres humanos, INH se ha encontrado que disminuir el aclaramiento de varios medicamentos, incluyendo la fenitoína (véase, por ejemplo, las referencias 3, 24. Y 30), carbamazepina (54. 58, 59), diazepam (36), triazolam (37), vincristina (7), primidona (48), y el acetaminofeno (10. 35), lo suficiente para requerir una reducción de la dosis o la interrupción del INH. Tras el examen de las principales vías metabólicas de los medicamentos afectados y las enzimas que catalizan ellas, muchas de estas interacciones fármaco-fármaco parece ser atribuible a los cambios farmacocinéticos que se pueden entender en términos de alteraciones de múltiples vías metabólicas medicamentos hepáticos catalizada por el citocromo P450 (CYP450) del sistema (2). De hecho, la capacidad de INH para inhibir el sistema CYP450 hepática in vitro en microsomas de hígado de rata se ha descrito (25. 34). En los animales (6), se ha demostrado que inhibe eficazmente INH para hidroxilación de la fenitoína in vivo. A pesar de la fuerte relación entre la interacción con otros medicamentos INH y la inhibición del sistema CYP450 ya pesar de su uso generalizado durante más de 4 décadas, nuestro conocimiento es incompleto con respecto a la cual se inhiben las isoformas del CYP450 específicos, por lo que la predicción de las interacciones medicamentosas con INH difícil. La única isoforma que se ha estudiado en detalle en modelos humanos y animales es CYP2E1, para lo cual INH se ha informado que tienen un efecto bifásico (inducción y la inhibición) (8). Esta propiedad de INH puede explicar el aumento del riesgo de hepatotoxicidad de los compuestos coadministrados (por ejemplo, etanol y acetaminofeno) (10, 33. 35), pero es poco probable para explicar las interacciones clínicamente documentados con otros medicamentos, ya que la mayoría de ellos parece estar catalizada por isoformas CYP distintos de CYP2E1 (por ejemplo, fenitoína por el CYP2C9 y CYP2C19 y carbamazepina por CYP3A y CYP2C8 2. 28). Con el fin de permitir a los médicos para mejorar las predicciones acerca de qué medicamentos pueden interactuar con INH, se realizó el presente estudio para evaluar la potencia inhibidora del INH en seis isoformas del citocromo P450 que metabolizan los medicamentos humanos comunes in vitro. Materiales y métodos Productos químicos. Isoniazida, fenitoína, fenacetina, acetaminofén, clorpropamida, midazolam, dextrometorfano, clorzoxazona, glucosa-6-fosfato, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, NADP, y la sal disódica de EDTA fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo .). S - Mephenytoin, 4-hidroxi-S - mephenytoin, 6-hydroxychlorzoxazone, 4-hydroxymidazolam, y 4-methylhydroxytolbutamide se adquirieron de ultrafina Químicos (Manchester, Reino Unido). Levalorfano se obtuvo de Convención de la Farmacopea EE. UU. (Rockville, Md.). El flurbiprofeno y 4-hydroxyflurbiprofen fueron proporcionados por Timothy Tracy, de la Universidad de Virginia Occidental Facultad de Farmacia. Dextrorfano y 3-metoximorfinano se adquirieron de Hoffman-La Roche, Inc. (Nutley, N. J.). N - (4-hidroxifenil) butamide fue proporcionado amablemente por John Strong (División de Farmacología Clínica, Centro para la Evaluación e Investigación de Medicamentos, Alimentos EE. UU. Administración de Drogas y, Rockville, Md.). El omeprazol es un generoso regalo de Tommy Andersson (Farmacología Clínica, Astra Haessle AB, Moelndal, Suecia). Otros reactivos fueron de cromatografía líquida de alta presión de grado (HPLC). VAM y CYP450s humana recombinante. Los microsomas hepáticos humanos utilizados se preparan a partir de tejido hepático humano que era médicamente aptas para el trasplante de hígado y se congelaron a 80 ° C dentro de 3 h de tiempo de pinzamiento. Las características de los donantes de hígado, el procedimiento para la preparación de fracciones microsomales, y su contenido CYP450 se han descrito en detalle en otra parte (19). Los pellets microsomales fueron resuspendidas en un tampón de reacción (0,1 M Na y fosfato de K, EDTA 1,0 mM, 5,0 mM MgCl 2. PH 7,4) a una concentración de proteína de 10 mg / ml (stock) y se mantuvieron a 80ºC hasta su uso. Las concentraciones de proteína se determinaron tal como se describe por Pollard et al. (41). Los protocolos detallados para la medición de cada actividad de la isoforma CYP utilizando sondas de reacción sustrato isoforma específica y sus parámetros cinéticos aparentes (K valores máximos V m) y se han descrito en nuestro trabajo anterior (11. 23. 47). Baculovirus-insecto celular expresado CYP2C19 humana y CYP2C9 (con reductasa) fueron adquiridos de Gentest Corporation (Woburn, Mass.) Y se almacenó a 80ºC. Las concentraciones de proteína y el contenido del citocromo P450 fueron suministradas por el fabricante. La inhibición de CYP450 por INH. Los efectos inhibidores de INH en las actividades de CYP1A2, -2C19, -2C8, -2D6, -2E1, y -3A fueron probados en VAM utilizando sondas selectivas para cada isoforma. Las sondas de reacción usadas fueron las siguientes: fenacetina O-desetilación para CYP1A2 (49) tolbutamida 4-methylhydroxylation (43) y flurbiprofeno 4-hidroxilación (53) para CYP2C9 S - mephenytoin 4-hidroxilación (60) y omeprazol 4-hidroxilación (20 ) para CYP2C19 dextrometorfano O-desmetilación para CYP2D6 (5) midazolam 4-hidroxilación (51), la formación de omeprazol sulfona (20), y el dextrometorfano N-desmetilación (16) para CYP3A y clorzoxazona 6-hidroxilación de CYP2E1 (40). El uso de condiciones de incubación específicos de cada isoforma de que fuera lineal por tiempo, sustrato, y las concentraciones de proteína como se detalla en nuestras publicaciones anteriores (11. 23, 47), las sondas de sustrato-isoforma específica se incubaron por duplicado a 37ºC con VAM y un generador de NADPH sistema en ausencia (control) o presencia de varias concentraciones (0 a 250 M) de INH. A menos que se especifique lo contrario, una preincubación de 5 min se llevó a cabo antes de que la reacción se inició mediante la adición de VAM. Para cada estudio de inhibición, los experimentos preliminares se llevaron a cabo mediante la incubación de una sola concentración de sustrato-isoforma específica alrededor de su K m con un intervalo de concentraciones de INH (0 a 250 M) o una concentración única INH (50 M). El 50 M (6,86 g / ml) la concentración de INH utilizada en estos experimentos se incluyó para representar las concentraciones de INH clínicamente relevantes en plasma durante el tratamiento (14). a continuación, se utilizó la simulación de los datos preliminares así obtenidos para generar concentraciones apropiadas de sustrato y INH para la determinación de las constantes de inhibición (exactas valores de Ki) de cada isoforma. Dixon parcelas para la inhibición por INH de cada sonda sustrato se realiza con dos VAM. Después de la terminación de las reacciones de incubación con reactivos apropiados, las muestras se centrifugaron y se inyectan en un sistema de HPLC, ya sea directamente o después de la reconstitución con fase móvil. Las concentraciones de los metabolitos y los estándares internos fueron medidos por HPLC con UV o detección fluorescente específico para cada ensayo. Las tasas de producción de cada metabolito de las sondas de sustrato se cuantificaron mediante el uso de la relación entre el área bajo la curva para el metabolito con el área bajo la curva para cada patrón interno usando una curva estándar apropiada. Las tasas de formación de metabolito de las sondas de sustrato en presencia de INH se compararon con los de los controles en los que el inhibidor se reemplazó con vehículo. HPLC. Los instrumentos utilizados para HPLC fueron controlados por un sistema Waters (Milford, Mass.) Millennium 2010 Chromatography Manager y incluyen un modelo Waters 510 o la bomba de HPLC 600, Waters 710B o 717 muestreador automático, Aguas detector UV 490 o 484, y Spectrovision FD-300 de doble monocromador detector de fluorescencia (Groton Technology Inc. Concord, Mass.). condiciones cromatográficas completas para cada ensayo se han descrito en otra parte (11. 23. 47). Los ensayos enzimáticos. Se midió la actividad de CYP1A2, -2C19, -2C9, -2D6, -2E1, y 3a, utilizando sondas específicas de reacción marcador. Las condiciones de incubación y métodos de HPLC para la medición de cada actividad de cada CYP se validan y se han utilizado rutinariamente en nuestro laboratorio, y los detalles se han publicado en varios de nuestros trabajos anteriores (11. 23. 47). Las concentraciones finales de INH utilizados en la incubación microsomal variaron de 5 a 250 M. Las concentraciones de sustratos fueron los siguientes: dextrometorfano, 10-60 MS - mephenytoin, 10-40 M omeprazol, 25-150 M tolbutamida, 15-75 M flurbiprofeno, 12-25 chlorzoxazone M, de 5 a 25 M fenacetina, 25-50 M y midazolam, 10-60 M. se midió CYP2C19 catalizada S - mephenytoin 4-hidroxilación y omeprazol 5-hidroxilación como se describió anteriormente (11. 23). La CYP2D6 catalizada dextrometorfano O-desmetilación a dextrorfano se ensayó como se describe por Broly et al. (5). La medición de la actividad de CYP3A se realizó utilizando dextrometorfano N-desmetilación (16), midazolam 4-hidroxilación (20), y la formación de sulfona omeprazol (20). La O-desetilación CYP1A2 catalizada de fenacetina al acetaminofeno se midió mediante un método descrito por Tassaneeyakul et al. (49) con modificaciones (23). El efecto de INH en la tasa de CYP2E1 catalizada chlorzoxazone 6-hidroxilación se evaluó por el método descrito por Peter et al. (40). CYP2C9 mediada se determinó 4-methylhydroxylation de tolbutamida en ambos VAM y CYP2C9 y CYP2C19 humana recombinante como se describe por Relling et al. (43) con ligeras modificaciones (23). El método de incubación de la tolbutamida 4-methylhydroxylation era el mismo que los de (ensayo de dextrometorfano) CYP2D6 y CYP3A descrito anteriormente excepto que el tiempo de incubación fue de 1 h en el caso de tolbutamida. La tolbutamida ha sido ampliamente utilizado para sondear la actividad de CYP2C9 in vivo e in vitro (31), pero los informes recientes implicar CYP2C19 en su metabolismo (1. 26). Debido a la interacción conocida de INH con la fenitoína (3. 24. 30), un sustrato de CYP2C9 y CYP2C19 (1. 28. 31), que caracteriza con más detalle el efecto inhibitorio de INH en CYP2C19 y CYP2C9. Se han utilizado tres enfoques. En primer lugar, hemos probado si tolbutamida es metabolizado por CYP2C19 y CYP2C9 isoformas humanas recombinantes y si INH tiene efectos inhibitorios similares en VAM y en las enzimas recombinantes. El segundo protocolo implicaban el uso de flurbiprofeno 4-hidroxilación como una sonda adicional (53) para definir el grado de inhibición de CYP2C9 en VAM por INH. Se realizó el ensayo de esta reacción como se describe por Tracy et al. (53). Por último, para poner a prueba para cualquier inhibición basado en el mecanismo de CYP2C9 por INH, VAM se preincubaron con un sistema generador de NADPH sin o con 100 y 250 M INH durante 0, 5, 15, y 30 min. Después de la iniciación de la reacción por adición de tolbutamida (50 M), la mezcla de incubación se incubó adicionalmente durante 1 h. Análisis de los datos. La velocidad de reacción de cada sonda sustrato en presencia de INH se expresó como el porcentaje de la velocidad de control sin INH presente. constantes de inhibición iniciales aproximados (valores de Ki) se calcularon a partir de experimentos que se realizaron utilizando un único múltiples concentraciones de INH sustrato y con el uso de la ecuación, suponiendo inhibición competitiva donde I es la concentración de INH, K i es la constante de inhibición, S es la concentración de sustrato, y K m es la concentración de sustrato en el medio de la velocidad máxima (V max) de la reacción. Las estimaciones para los parámetros cinéticos a partir de este análisis se utilizaron para generar concentraciones óptimas simulado por ordenador de sustrato y INH para la determinación de las parcelas de Dixon. Se ajustaron los datos de inhibición de parcelas Dixon para apropiarse de modelos de regresión no lineal de la inhibición de la enzima, y ​​precisa los valores de Ki se calcularon (WinNonlin versión 1.5 Consulting Scientific, Inc. Apex, Carolina del Norte). Los valores de K i obtenidos a partir de la inspección visual de Dixon o secundarios Lineweaver-Burk parcelas sirven como estimaciones iniciales para esta determinación. Un modelo y mecanismo de inhibición apropiada se decidieron de forma gráfica y de los parámetros del modelo (por ejemplo, la dispersión de los residuos y los errores estándar de las estimaciones de los parámetros). RESULTADOS Se evaluaron el efecto inhibidor de INH sobre las actividades de las isoformas del CYP450 humanas metabolizadoras de fármacos comunes, según la evaluación de las reacciones de sonda sustrato isoforma específica. En primer lugar, se llevaron a cabo experimentos preliminares que implicaban la incubación de una concentración única de cada sonda reacción del sustrato alrededor de su respectivo valor de Km con múltiples concentraciones de INH (0 a 250 M) en VAM. Los datos resumidos en la Figura 1 demuestran que INH en un único (50 M) (Fig. 1 A) o múltiples (0 a 250 M) (Fig. 1 B) inhibieron concentraciones constantemente las actividades de CYP2C19 y CYP3A relación con los de las otras isoformas probados. Los datos en la Fig. 1 a continuación, se utilizaron para simular los rangos apropiados de sustrato y concentraciones de inhibidor para construir parcelas Dixon para la inhibición de cada isoforma de INH en VAM o CYP450s recombinantes para la estimación precisa de las constantes de inhibición (valores de K i). La inhibición de las isoformas del CYP450 por INH a 50 M (A) y de 0 a 250 M (B) en VAM. La actividad de cada isoforma se midió mediante sondas isoforma específica de reacción del sustrato a aproximadamente sus respectivos valores de Km: 60 M para la fenacetina O-desetilación (CYP1A2) 25 M para el dextrometorfano (CYP2D6) 25 M para midazolam 4-hidroxilación (CYP3A) 50 M para el omeprazol (CYP2C19) 50 M para la tolbutamida (CYP2C9) y 25 M de chlorzoxazona (CYP2E1). Los datos representan los promedios de los duplicados. actividad CYP2C19. Como se muestra en la Fig. 1 A, INH (50 M) inhibió la actividad de CYP2C19 catalizada omeprazol 5-hidroxilación de aproximadamente 40. El grado de inhibición era dependiente de la concentración INH utilizado (34 a 25 M, 42 a 50 M, y 70 a 250 M INH) (Figura 1 B). Esta inhibición de la CYP2C19 por INH fue similar en VAM y CYP2C19 humana recombinante para ambos sustratos (omeprazol y S - mephenytoin) a prueba (Figura 2). parcelas representativas Dixon para la inhibición de la CYP2C19 en VAM y CYP2C19 recombinante se demuestran en la Fig. 3 A y B, respectivamente. Claramente, INH es un inhibidor competitivo potente, con una media de valores de Ki de 25 y 13 M, respectivamente (Tabla 1). efecto inhibidor de INH (0 a 250 M) en CYP2C19 omeprazol catalizada por 5-hidroxilación en VAM y CYP2C19 humana recombinante. Los datos representan las medias de determinaciones por duplicado. Dixon parcelas para la inhibición de la CYP2C19 catalizada omeprazol 5-hidroxilación por INH (0 a 250 M) en VAM (A) y S-mefenitoína 4-hidroxilación por INH (0 a 100 M) en CYP2C19 humana recombinante (B). Cada punto representa la media de determinaciones por duplicado. La potencia inhibidora del INH de CYP450 isoformas una actividad de CYP3A. La inhibición de CYP3A por INH se evaluó en primer lugar usando una sola concentración de midazolam, aproximadamente a la K m. como una sonda de sustrato en VAM. Como se muestra en la Fig. 1. INH inhibe potentemente la actividad de CYP3A de una manera dependiente de la concentración. A concentraciones terapéuticamente relevantes de INH (por ejemplo, 50 H 14. 52. 57), más de 40 de la actividad de CYP3A se inhibió. Dado que el grado de inhibición de CYP3A puede ser dependiente de sustrato, hemos probado la capacidad de INH para inhibir el CYP3A en VAM utilizando tres reacciones diferentes sondas sustrato: midazolam 4-hidroxilación, la formación de sulfona omeprazol, y el dextrometorfano N-desmetilación. parcelas Dixon representativos para la inhibición de reacciones catalizadas por CYP3A se muestran en la Fig.4. y los correspondientes valores de Ki derivadas de estos datos se enumeran en la Tabla 1. INH mostró una inhibición comparable no competitivo de la formación de sulfona omeprazol (K i. 52 M) y midazolam 4-hidroxilación (K i. 76 M), pero era de seis a nueve veces más débiles como un inhibidor competitivo de dextrometorfano N-desmetilación. Dixon parcelas para la inhibición de la formación catalizada por CYP3A sulfona omeprazol (A), midazolam 4-hidroxilación (B), y el dextrometorfano N-desmetilación (C) por INH en VAM. Las concentraciones de INH utilizados fueron 0 a 100 M (A y B) y 0 a 250 M (C). Cada punto representa la media de determinaciones por duplicado. actividad de CYP2C9. Como se demuestra en la Fig. 1. inhibición de la tolbutamida 4-methylhydroxylation por INH en VAM fue mínima. Incluso en concentraciones supraterapéuticas de INH, la inhibición no excediera 15. Según lo revelado en la Fig. 5 A, INH tuvo poco efecto sobre flurbiprofeno 4-hidroxilación (otra sonda de CYP2C9) o tolbutamida 4-methylhydroxylation en VAM. La representación de Dixon para la inhibición de la tolbutamida 4-methylhydroxylation por INH (Fig. 5 B) se construyó utilizando CYP2C9 humana recombinante. El valor de Ki derivada de esta representación de Dixon (100 M) fue de cuatro y ocho veces mayor que el obtenido para la inhibición de la CYP2C19 en VAM y CYP2C19 humana recombinante, respectivamente (Tabla 1). Para explorar el potencial de inhibición basado en el mecanismo, que preincubaron INH con microsomas de hígado humano en presencia de un sistema generador de NADPH antes de la adición de tolbutamida como sonda sustrato. No hubo ningún efecto adicional de INH en la actividad catalítica de CYP2C9 debido a la preincubación (Fig. 5 C). efecto inhibidor de CYP2C9 INH en catalizada 4-methylhydroxylation y flurbiprofeno 4-hidroxilación. (A) La inhibición de CYP2C9 (con TB tolbutamida 20 y 40 M y flurbiprofeno FB 13 y 25 M como sustratos) por INH (0 a 250 M) en VAM (B) parcelas Dixon para la inhibición por INH de CYP2C9 (con tolbutamida) en efecto recombinante humana CYP2C9 (C) inhibidora del INH (0 a 250 M) en CYP2C9 (con tolbutamida 50 M) con preincubación (PI) o sin preincubación en VAM (ver Materiales y Métodos para más detalles). Los datos son promedios para las incubaciones duplicadas. actividad de CYP2E1. INH es un inhibidor moderado del CYP2E1 catalizada chlorzoxazona 6-hidroxilación en VAM (Fig. 1) and6. A concentraciones terapéuticamente relevantes INH, el grado de inhibición fue 20. Desde este hallazgo contradice nuestras expectativas iniciales, se realizó un experimento de inhibición de control positivo usando los mismos VAM con dietilditiocarbamato, un conocido inhibidor de CYP2E1. Según lo revelado en la Fig. 6 A, dietilditiocarbamato era de hecho un fuerte inhibidor de CYP2E1 catalizada chlorzoxazone 6-hidroxilación relativa a la inhibición por INH. La representación de Dixon para la inhibición de CYP2E1 por INH (Fig. 6 B) mostró que INH es un inhibidor competitivo en VAM, con un valor de K i de 110 M. La inhibición de CYP2E1 mediada chlorzoxazone 6-hidroxilación por INH. (A) El porcentaje de inhibición de la actividad de CYP2E1 (con clorzoxazona 25 M) por INH y dietilditiocarbamato (DEDTC) como un control positivo en VAM (B) Representante Dixon parcelas para la inhibición de la actividad de CYP2E1 por INH (25-250 M) en VAM. Los datos representan los promedios de los duplicados. CYP2D6 y CYP1A2 actividades. INH mostró débil inhibición de CYP2D6 (Fig. 1), con un valor de K i de 100 M (Tabla 1). El gráfico representativo Dixon para la inhibición de CYP2D6 por INH (Fig. 7 A) y análisis de los parámetros del modelo de inhibición de la enzima sugieren que el tipo de inhibición es competitiva. La capacidad de INH para inhibir mediado por CYP1A2, fenacetina O-desetilación era insignificante en la fenacetina a una sola concentración (50 M) se incubó con INH en múltiples concentraciones. A la concentración más alta ensayada INH (250 M), la formación de paracetamol fue inhibida por la única 16. Dado que no se encontró ninguna inhibición significativa de la CYP1A2 a dos concentraciones de fenacetina (Fig. 7 B), no se intentó llevar a cabo más análisis. El valor de Ki dan en la Tabla 1 es una estimación aproximada de estos datos utilizando la ecuación en la sección de análisis de datos anterior. La inhibición de la CYP2D6 dextrometorfano catalizada por O-desmetilación y CYP1A2-O-catalizada desetilación por INH en VAM. (A) Dixon traza para la inhibición de CYP2D6 (INH, 0 a 250 M) (B) porcentaje de inhibición de CYP1A2 (con fenacetina 25 y 50 M como sustrato) (INH, 0 a 250 M). Cada punto representa la media de determinaciones por duplicado. DISCUSIÓN La capacidad de INH para causar interacciones adversas a los medicamentos con una serie de medicamentos cuyo aclaramiento depende del sistema CYP450 (Tabla 2) (2. 46. 57) ha sido bien documentado, pero las isoformas específicas inhibidas por INH no se entienden completamente . En este estudio proporcionan la primera evaluación completa de la inhibición de seis isoformas del citocromo P450 que metabolizan los medicamentos por INH y proporcionan la base científica con la que explicar las interacciones entre medicamentos documentados con INH y predecir otros nuevos. Esto es particularmente oportuno ya que es probable que se coprescribed con INH una serie de medicamentos desarrollados recientemente para el tratamiento de VIH y las infecciones oportunistas, así como otras enfermedades (por ejemplo, la depresión y la tuberculosis resistente a los medicamentos). Las interacciones farmacológicas potencialmente relacionados con la inhibición de la CYP450s por INH Nuestros datos demuestran que INH es un fuerte inhibidor de CYP2C19, que es genéticamente una enzima polimórfica que está involucrado en el metabolismo de varios fármacos clínicamente importantes, incluyendo la fenitoína, omeprazol, antidepresivos (por ejemplo, citalopram), proguanil, y nelfinavir (15. 29). Si nuestros datos de inhibición puede predecir situaciones in vivo, esperamos que INH va a alterar la farmacocinética de los fármacos que son sustratos del CYP2C19. La relevancia clínica de la inhibición inducida por INH de CYP2C19 puede ilustrarse mejor mediante el examen de la interacción clínica INH-fenitoína documentado en la literatura. toxicidad fenitoína asociados con concentraciones elevadas en el plasma es la interacción más claramente y con frecuencia documentado descrito hasta ahora para los pacientes que tomaron de forma concomitante INH (Tabla 2). En experimentos con animales, se ha demostrado que inhibe INH parahydroxylation de la fenitoína (6. 8. 25). Aunque CYP2C9 se ha sugerido que es una enzima importante responsable de la oxidación de la fenitoína (31), evidencia de que también implica CYP2C19 como un determinante importante de la farmacocinética de fenitoína, en particular a concentraciones más altas está evolucionando (1. 28). Recientemente hemos demostrado que la ticlopidina fármaco antiplaquetario, un inhibidor preferencial de CYP2C19 (con poco efecto sobre CYP2C9) in vivo e in vitro (13. 22. 50), entorpece seriamente la eliminación de la fenitoína en los seres humanos (12). Otros fármacos que son potentes CYP2C19 (pero no CYP2C9) inhibidores, incluyendo omeprazol, felbamato, y topiramato, se ha informado de que aumenten las concentraciones en plasma y / o toxicidad de la fenitoína (28). Por otra parte, no tenemos ninguna evidencia de la literatura que INH inhibe la eliminación de los sustratos del CYP2C9 distintos a la fenitoína. Un caso de aumento de la warfarina (en / 10 mg día) toxicidad (tiempo de aumento de la protrombina, hematuria, y sangrado de las encías) causada por INH fue descrito en 1977 (46). Esta interacción farmacológica adversa se produjo después de que el paciente inadvertidamente tomó 10 dosis adicionales de INH (600 mg / día), pero no se le ocurrió a una dosis terapéutica habitual de INH (300 mg / día). El hecho de que sólo hay un caso clínico de interacción de fármacos INH-warfarina a dosis altas en comparación con los frecuentes informes de la interacción fenitoína a pesar de la utilización más amplia de INH y warfarina (un sustrato de CYP2C9) (31) sugiere que las dosis terapéuticas de INH tienen poco efecto sobre las drogas sustrato del CYP2C9. Estos y nuestros datos in vitro nos llevan a creer que la inhibición del metabolismo mediado por CYP2C19 de fenitoína por INH ofrece una explicación clara para el aumento del riesgo de toxicidad por fenitoína clínica durante la coadministración INH. Esto significa que CYP2C19 es una enzima importante en el metabolismo de la fenitoína, particularmente cuando la actividad de la vía alternativa (CYP2C9) es baja. Aunque nuestros datos tienen especial relevancia para la eliminación de la fenitoína debido a sus propiedades farmacocinéticas saturables (28), también esperaríamos INH para alterar las acciones terapéuticos y tóxicos de otros fármacos sustrato CYP2C19, incluyendo omeprazol, diazepam, citalopram, nelfinavir, y proguanil ( 15. 29). La inhibición de la actividad de CYP3A por INH se produjo a concentraciones cercanas a la gama terapéutica y puede explicar en parte algunas de las interacciones de drogas reportados en la literatura con INH, que incluyen interacciones con la carbamazepina, etosuximida, y vincristina (Tabla2). En vista del importante papel de CYP3A en el metabolismo de los fármacos en el hígado y el intestino y debido a la posibilidad de que la administración conjunta de INH con sustratos de CYP3A (por ejemplo, inhibidores de proteasa), nuestro hallazgo puede tener una gran importancia clínica. Mientras que la inhibición era relativamente potente cuando se utilizó la formación de sulfona omeprazol o hidroxilación midazolam como reacciones de sonda, es importante tener en cuenta que la inhibición de dextrometorfano N-desmetilación fue débil y competitivo en la naturaleza. Esto vuelve a enfatizar el hecho de que la inhibición del metabolismo mediado por CYP3A es sustrato dependiente, o podría indicar que el dextrometorfano N-desmetilación es una sonda no específica de CYP3A (56). La inhibición débil por INH de CYP2E1 mediada chlorzoxazona 6-hidroxilación que hemos observado en este estudio no está de acuerdo con estudios in vivo. Estudios in vivo han demostrado de manera inequívoca que INH tiene un efecto doble sobre la actividad de CYP2E1, es decir, la inhibición y la inducción (8. 27. 38). Disminuye los espacios libres de sustratos de CYP2E1 (clorzoxazona, acetaminofeno, etanol, y agentes anestésicos halogenados Tabla 2) a través de la unión competitiva con el sitio activo de la enzima cuando una concentración adecuada de INH en plasma está disponible. Funciona como un inductor de CYP2E1, probablemente a través de la estabilización del ligando, una vez que se suspende el medicamento y la concentración en plasma alcanza niveles no detectables (8). Por lo tanto, la consecuencia farmacocinético de interacción con CYP2E1 podría ser una disminución, ningún cambio, o un aumento del aclaramiento de una sonda de sustrato, dependiendo de la dosis de INH y el tiempo entre la última ingestión de INH y la ingestión de la sonda de sustrato ( 8). Hay un número de posibles explicaciones para la falta de un fuerte efecto de INH en la actividad de CYP2E1 in vitro. En primer lugar, es posible que INH es un inhibidor basado en mecanismo de CYP2E1. De hecho, CYP2E1 está implicada en la hepatotoxicidad inducida por INH (44), lo que sugiere que INH o un metabolito puede ser un sustrato de CYP2E1 y que este metabolito, por ser un sustrato de esta isoforma, puede ser un inhibidor competitivo de CYP2E1. Preincubaciones de INH con VAM y un sistema generador de NADPH antes de la adición del sustrato es poco probable que revelan una interacción basada en el mecanismo, debido a que el metabolismo primario de INH en los seres humanos no implica CYP450s (57). Por otra parte, el efecto de los metabolitos sintéticas conocidas de INH en la actividad de CYP2E1 puede proporcionar información sobre el papel de los metabolitos específicos, pero tenemos poco conocimiento de las concentraciones terapéuticas de la mayoría de los metabolitos INH. En segundo lugar, INH puede ser rápidamente agotado en comparación con chlorzoxazone en nuestra incubación in vitro, lo que lleva a la inhibición incompleta. No medimos la evolución temporal de la desaparición INH en las mezclas de incubación HLM. Se requieren más estudios para aclarar todas estas posibilidades, ya que esto puede proporcionar las bases no sólo para la inhibición de CYP2E1, sino también para los mecanismos por los cuales la INH produce hepatotoxicidad o aumenta el riesgo de hepatotoxicidad de los fármacos administrados conjuntamente otros. Hemos demostrado que el INH es un inhibidor de dos importantes isoformas del citocromo P450 in vitro, y estos datos proporcionan la base con la que identificar posibles interacciones entre medicamentos durante el tratamiento con INH. interacciones INH-fenitoína documentados en la literatura parecen estar mediados a través de la inhibición de la CYP2C19. La inhibición de la CYP2C19 y / o CYP3A es el mecanismo probable por el cual INH ralentiza la eliminación de varios fármacos administrados conjuntamente (Tabla 2), incluyendo carbamazepina (CYP3A), diazepam (CYP3A y CYP2C19), triazolam (CYP3A) y vincristina (CYP3A). INH también inhibe el metabolismo de fármacos como la primidona y etosuximida (Tabla 2), pero debido a la falta de conocimientos sobre las isoformas que catalizan estas drogas, es difícil asignar un mecanismo para estas interacciones. Además del efecto de INH en xenobióticos, existe la posibilidad de que la administración crónica INH puede inhibir significativamente el metabolismo endobiotic por CYP2C19, CYP3A, u otras enzimas y modificar sus acciones bioquímicas. Por lo tanto, INH se ha informado de inhibir el metabolismo de la vitamina D y el cortisol en los seres humanos (4) y la oxidación de los leucotrienos en los animales (39). En los seres humanos, se somete a INH N acetilación N-acetiltransferasa por, y la expresión polimórfica genética de esta enzima es la principal causa de la alta variabilidad interindividual en la farmacocinética de INH (52. 57). Dos subgrupos distintos (acetiladores lentos y rápidos) que difieren en su capacidad para metabolizar INH se han identificado entre los humanos.